Entre os primeiros seguidores e apóstolos de Jesus, Mateus é mencionado em Mateus 9:9 e Mateus 10:3 como tendo sido um coletor de impostos de Cafarnaum que foi convidado para o círculo dos Doze por Jesus. Ele também é mencionado como um dos doze apóstolos, embora sem a menção de sua profissão anterior, em Marcos 3:18, Lucas 6:15 e Atos 1:13. Ele é geralmente identificado como sendo o Levi, filho de Alfeu, também coletor de impostos e que é citado em Marcos 2:14 e Lucas 5:27.
Durante a ocupação romana, que iniciou em 63 a.C. com a conquista de Pompeu, Mateus coletava impostos do povo hebreu para Herodes Antipas, o tetrarca da Galileia. Sua coletoria estava localizada em Cafarnaum. Judeus que enriqueciam desta maneira era desprezados e considerados párias. Porém, como um coletor de impostos, ele deve ter alfabetizado em aramaico (ainda que provavelmente não em grego e nem em latim).
Foi neste cenário, perto de onde hoje está Almagor, que Jesus convidou Mateus para ser um dos Doze Apóstolos. Após o chamado, Mateus convidou Jesus para um banquete em sua casa. Ao ver isto, os escribas e os fariseus criticaram Jesus por cear com coletores de impostos e pecadores. A provocação fez Jesus responder, «Não vim chamar os justos, mas os pecadores ao arrependimento.» (Lucas 5:29).
O ministério de Mateus no Novo Testamento é bastante complexo de atestar. Quando ele é mencionado, é geralmente junto com Tomé. Como discípulo, ele seguiu Cristo e foi uma das testemunhas da Ressurreição e da Ascensão. Depois, Mateus, Maria, Tiago e outros seguidores próximos a Jesus se recolheram ao cenáculo em Jerusalém. Na mesma época, Tiago sucedeu a Jesus como líder da igreja de Jerusalém.
Eles permaneceram nas redondezas de Jerusalém e proclamaram que Jesus, filho de José, era o Messias prometido nas profecias. Acredita-se que estes primeiros cristãos judeus eram chamados de nazarenos:pp. 597&722. É quase certo que Mateus era um deles, uma vez que tanto o Novo Testamento quanto o Talmud assim atestam.
Mateus pregou por quinze anos o Evangelho em hebraico para a comunidade judaica na Judeia. Mais tarde, ele viajaria pelas nações gentias (presumivelmente seguindo o ordenamento de Jesus em Mateus 28:16-20) e espalhou os ensinamentos de Jesus entre os etíopes, macedonianos, persas e partos. Acredita-se também que ele tenha morrido uma morte natural, na Etiópia ou na Macedônia. Porém, tanto a Igreja Católica quanto a Ortodoxa sustentam a crença tradicional de que ele tenha morrido mártir